新奇光電生物傳感器實驗過程詳細解析

檢測中，熒光團與靶分子(待測分子)結(jié)合，再與探針(錨定在玻片上的一個DNA鏈)雜交，然后使用光學掃描儀檢測DNA.本文的目的是推薦使用一個新奇的傳感器替代傳統(tǒng)檢測系統(tǒng)，該傳感器基于硅光電倍增管或SiPM,即將若干個固態(tài)光電檢測器排成像素陣列;另一個目的是研究新型熒光染料。硅光電倍增管由像素數(shù)量不同(25-400個像素)的陣列組成，用于在各種溶液中檢測CY5和Ru(bpy)32+染料的熒光，為硅光電倍增管在DNA-Chip測量中的應用創(chuàng)造了機會。

　　硅光電倍增管(SiPM)是一種創(chuàng)新的Geiger模式的固態(tài)光電檢測器。硅光電倍增管結(jié)構(gòu)是若干個相等的單個像素并排組成的陣列，每個像素都是一個集成降壓電阻的硅p-n結(jié)雪崩光電二極管(SPAD)。所有像素都并聯(lián)至一個統(tǒng)一的輸出點，因此，輸出信號是各個像素產(chǎn)生的信號的總合，并與光子碰撞的單元數(shù)量成正比。硅光電倍增管是一個很有前景的光電檢測解決方案，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)光電倍增管(PMT)，該技術(shù)的某些特性引起人們的興趣，例如，對磁場不敏感的特性使之適用于強磁場工作環(huán)境;穩(wěn)健性和可靠性高于傳統(tǒng)光電倍增管;工作電壓更低，價格更便宜，反應速度更快，尺寸更小。高速、高靈敏度和小尺寸讓硅光電倍增管成為最佳的便攜應用光電檢測器。當然，在各種應用領(lǐng)域，生物傳感器是最令人期待的目標應用，不過，作為熒光檢測器，硅光電倍增管被推薦用于生物傳感器的文獻并不是很多。基于DNA-Chip的解決方案通過熒光測量方法同時測定大量基因的表達量。CY3和CY5(發(fā)射波長分別為570nm和670nm)是標記DNA目標的傳統(tǒng)熒光團。

　　其中，Ru(bpy)32的某些獨有特性使其可以替代傳統(tǒng)熒光團，成為新的備用熒光團。事實上，該熒光團的最大吸收波長和最大發(fā)射波長分別為450nm(金屬配體轉(zhuǎn)移)和630nm,這一間隔范圍可簡化熒光檢測器設(shè)計，準許使用價格低廉的低功率LED管代替昂貴的激光管。

　　有很多問題能影響集成光電檢測系統(tǒng)的實現(xiàn)，為發(fā)現(xiàn)所有的問題，本文設(shè)定一個雙重探討目標：將熒光團作為溶液參數(shù)(鹽水與染料溶液的濃度)加以研究;探討硅光電倍增管在測量生物樣本熒光過程中的性能表現(xiàn)。

　　實驗儀器工具

　　待測產(chǎn)品描述：本文中的被測硅光電倍增管是意法半導體卡塔尼亞(意大利)研發(fā)中心研制的多片光電檢測解決方案[2].該多片方案共有7個光電檢測器，其中像素數(shù)量從1個到400個。具體地說，單像素檢測器(圖g)1個，而25像素(圖a和d)、100像素(圖b和e)和400像素(圖c和f)點陣式檢測器各有兩個，(按尺寸劃分)分為有光溝槽和無光溝槽兩類。為了對所選器件施加偏壓，采集輸出信號，多片光電倍增管被焊接到一個敞開的32引腳封裝內(nèi)。

　　多片光電倍增管結(jié)構(gòu)圖，其中a、b、c和d、e、f分別代表5×5、10×10、20×20像素有溝槽和無溝槽光電檢測器;g是單像素光電檢測器

　　樣品制備：將CY5(取自iCycleriQCalibratorDyeSolutionSet#170-8792,Bio-rad)和100μg/mlRu(bpy)32+置于三種不同的溶濟中：H2OmilliQ、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)0.1M和PBS0.01M.。CY5被稀釋成30%和40%兩種濃度。PBS是一種用NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4制成的鹽水溶液。若需要，加適量稀鹽酸(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)，將pH值調(diào)到7.2。PBS用于測試鹽的存在對染料熒光的影響，我們發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，取每種溶液2μl,置于玻片(選擇玻片的原因是其厚度為0.13-0.16mm)上，形成直徑幾毫米的液滴。將玻片樣品置于干燥器內(nèi)，風干30分鐘(30‘)。

　　測量儀器：實驗人員用下面圖2所示的儀器工具測定樣品發(fā)射的熒光信號。激光二極管(相干立方體激光器)負責發(fā)射光線，PC機控制發(fā)射光。發(fā)射光在撞擊樣本前，被濾波器衰減30dB。我們使用兩個660nm或403nm波長的激光二極管分別激發(fā)CY5和Ru(bpy)32+.測定照射樣品的激光的功率，該功率是電激光二極管功率的一個函數(shù)。當電激光功率在10-80mW時，照射樣品的激光的功率在11-113μW之間。

測量儀器工具

　　硅光電倍增管設(shè)為連續(xù)工作模式，并連至Keithley236源測量儀，將硅光電倍增管置于角度計上，以便讓操作人員能夠觀察不同發(fā)射角的熒光信號。樣本置于激光二極管的同一光軸上，光線正常照射樣本表面。將硅光電倍增管用作光子計數(shù)器，使用脈沖工作模式檢測非常微弱的熒光信號。用安捷倫脈沖發(fā)生器Agilent81110A驅(qū)動激光二極管取得的脈沖激光波形(周期10ms,波長4ns)測量CY5樣本發(fā)射的光子。在這種情況下，同樣讓激光正常照射置于同一光軸上的樣本，將硅光電倍增管與激光二極管置于同一平面上，且與激光管光軸的夾角為60°，用硅光電倍增管檢測樣本發(fā)射的熒光。該指定角度可確保被檢測到的光噪聲(玻片反射的激光)最低。向硅光電倍增管施加-30V或-32V偏壓。若需要更高的信號強度，則施加更高的偏壓。用示波儀(TektronixDPO7104)記錄檢測到的信號，通過專門開發(fā)的Labview軟件采集信號，在PC機?

　　使用Matlab軟件對信號進行后分析。